Th17/Treg值在慢性乙型肝炎肝纖維化進展中的意義

2020-06-12 11:47:17 《中外醫療》 2020年8期

付海洋 時維平 付廣明 張蓓 史海磊 李雪健

[摘要] 目的 測定慢性乙型肝炎(CHB)患者肝纖維化進展過程中外周血中Th17細胞和Treg細胞的頻率及相關細胞因子的變化,以及肝組織中Th17細胞和Treg細胞數目的變化,探討Th17/Treg平衡在纖維化進展中的作用。方法 方便選取2017年6—12月青島大學附屬醫院慢性乙型肝炎住院患者51例,其中F1期CHB患者(F1)5例,F2期CHB患者(F2)10例,F3期CHB患者(F3)15例,F4期CHB患者(F4)21例,同時選取10位健康體檢者作為對照(HC),流式細胞術檢測外周血中Th17和Treg的頻數,雙抗體夾心ELISA檢測血清中IL-17和IL-10的表達水平,免疫組化檢測CHB患者肝組織中Th17和Treg數量。 結果 在外周血中, Th17/Treg細胞頻率比值在F2組(0.76±0.37)和F4組(2.23±0.67)中與HC組(1.33±0.67)相比,差異有統計學意義[P(HCvsF2)=0.022,P(HCvsF4)<0.001],IL-17/IL-10比值在F2組(0.11±0.19)、F3組(0.12±0.32)和F4組(0.12±0.32)中與HC組(0.72±0.22)相比,差異有統計學意義[P(HCvsF2)=0.008,P(HCvsF3)=0.001,P(HCvsF4)<0.001],肝組織中,Th17/Treg比值在F3組(1.07±0.86)和F4組(0.79±0.28)中與F1組(2.08±1.06)相比,差異有統計學意義[P(F1vsF3)=0.008, P(F1vsF4)=0.001],F2組(1.51±0.77)和F4組(0.79±0.28)相比,Th17/Treg值變化差異有統計學意義[P(F2vsF4)=0.011]。 結論 Th17/Treg的失衡是造成慢性乙型肝炎肝纖維化進程演變的重要因素,檢測Th17/Treg變化對預測肝纖維化發展有一定價值。

[關鍵詞] 慢性乙型肝炎;Th17細胞;調節性T細胞;IL-17;IL-10;肝纖維化

[Abstract] Objective To determine the frequency of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood and the changes of related cytokines and the number of Th17 cells and Treg cells in liver tissue during the progression of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis B (CHB). Role of Th17 / Treg balance in fibrosis progression was explored. Methods A total of 51 hospitalized patients with chronic hepatitis B from the affiliated hospital of Qingdao University from June 2017 to December 2017 were convenient selected, including 5 patients with stage F1 CHB (F1), 10 patients with stage F2 (F2), and 15 patients with stage F3 (F3); 21 cases of F4 stage CHB patients (F4), 10 healthy subjects were selected as controls (HC), the frequency of Th17 and Treg in peripheral blood was detected by flow cytometry, and the serum IL was detected by double antibody sandwich ELISA expression levels of IL-17 and IL-10 were detected by immunohistochemistry in the amount of Th17 and Treg in liver tissue of patients with CHB. Results In peripheral blood, the ratio of Th17 / Treg cell frequency in the F2 group (0.76±0.37) and the F4 group (2.23±0.67) was significantly different from that in the HC group (1.33±0.67)[P(HCvsF2) = 0.022, P(HCvsF4)<0.001], the ratio of IL-17/IL-10 in the F2 group (0.11±0.19), F3 group (0.12±0.32) and F4 group (0.12±0.32) compared with the HC group (0.72±0.22), the difference was statistically significant[P(HCvsF2) = 0.008, P(HCvsF3) = 0.001, P(HCvsF4)<0.001], Th17 / Treg ratio in liver tissues was in F3 group (1.07±0.86) and F4 group (0.79±0.28), compared with the F1 group (2.08±1.06), the difference is statistically significant[P(F1vsF3) = 0.008, P (F1vsF4) = 0.001], compared with the F2 group (1.51±0.77) and the F4 group (0.79±0.28). The difference in Th17 / Treg values was statistically significant[P (F2vsF4)=0.011]. Conclusion The imbalance of Th17 / Treg is an important factor in the evolution of liver fibrosis in chronic hepatitis B. Detection of changes in Th17 / Treg is of certain value in predicting the development of liver fibrosis.

[Key words] Chronic hepatitis B; Th17 cells; Regulatory T cells; IL-17; IL-10; Liver fibrosis

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒感染引起的復雜的肝臟免疫性疾病。我國作為乙型肝炎高發國家,CHB患者約有2 300萬,病毒攜帶者數量高達1.3億,每年約有50萬以上死于乙肝引起的肝硬化、肝癌。HBV病毒在體內導致的肝纖維化是多種慢性肝病的病變基礎,隨著纖維化的進展易發展成肝硬化,具有很高的病死率,嚴重威脅患者的生命健康,因此早期診斷及治療具有重要意義[1]。乙肝病毒在體內難以清除,關鍵在于免疫應答不利,近年來研究發現,輔助性T細胞17(T helper cells 17,Th17)與調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)同屬CD4+T細胞的兩組新亞群,它們在維持機體免疫平衡及自身耐受中具有重要的作用[2]。為此,該研究以CHB患者為研究對象,方便選取2017年6—12月青島大學附屬醫院慢性乙型肝炎住院患者51例,檢測CHB患者肝纖維化進展過程中外周血中Th17與Treg細胞頻率及相關細胞因子水平的變化,以及肝組織中Th17與Treg細胞的數目,并選取10例健康者作為對照,分析Th17/Treg細胞的失衡與肝纖維化發生發展的相關性,并探討其意義,現報道如下。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

方便選擇青島大學附屬醫院消化內科及肝臟科CHB住院患者51例,男34例,女17例,其中F1期CHB患者(F1)5例,F2期CHB患者(F2)10例,F3期CHB患者(F3)15例,F4期CHB患者(F4)21例。慢性乙型肝炎性肝纖維化程度分級、分期標準參照2015年中華醫學會肝病學分會與感染病分會聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》,同時選取10位健康體檢者作為對照組(healthy controls,HC),年齡25~46歲(平均年齡44.2歲),無相關免疫性疾病、腫瘤或近期感染。組間性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。該研究經醫院倫理學委員會批準,患者、體檢者均知情同意。

該研究所用的主要試劑和儀器如下:PMA購自Sigma公司,Ionomycin購自Veasen公司,1640培養基購自Hyclone公司,Human Th17/Treg Phenotyping Kit試劑盒購自BD 公司, 人白介素17 酶聯免疫試劑盒和人白介素10 酶聯免疫試劑盒購自博凌科為公司,免疫組化一抗IL-17和Foxp3購自北京博奧森生物技術有限公司,蘇木素、伊紅、Masson三色試劑購自珠海貝索生物技術有限公司。EVOLIS全自動酶標儀為Bio-Rad公司產品,FACSCanto plus流式細胞儀為BD?Biosciences公司產品。

1.2? 方法

1.2.1? 流式細胞術檢測Th17和Treg細胞的頻率? 采集每組實驗者清晨空腹靜脈血2 mL,于EDTA抗凝管中并編號,加入等體積生理鹽水混勻,用滴管向底部緩緩加入1/3體積的Ficoll分離液,500 g離心力離心20 min,升7降3,吸取PBMC層,加入2 mL PBS,500 g離心力離心5 min,洗滌兩遍。1640完全培養基重懸細胞備用。每個樣本取1×106個細胞,用200 μL含刺激劑的培養液重懸細胞,37℃,5%CO2培養5 h。250 g離心力離心5 min后收集細胞,加入2 mL Buffer A固定細胞,室溫避光孵育20 min。500 g離心力離心5 min,棄上清,加入2 mL Stain buffer重懸細胞,500 g離心力離心5 min,棄上清。每管加入500 μL 1×Buffer C固定破膜液,室溫避光孵育30 min。每管加入2 mL Stain buffer,500 g離心力離心5 min。重復此步驟1次。100 μL Stain buffer重懸細胞,按20 μL/test加入抗體,室溫避光孵育40 min。每管加入2 mL Stain buffer,500 g離心力離心5 min。重復此步驟一次。棄上清,加入300 μL Stain buffer重懸后,上機檢測。

1.2.2? ELISA檢測血清IL-17和IL-10水平? 采集每組實驗者清晨空腹外周血5 mL,3 000 r/min離心3 min后分離血清儲存于-80℃冰箱備用。收集全部標本后,取上述血清標本室溫凍融后采用雙抗體夾心ELISA測定IL-17和IL-10水平,操作遵循試劑盒說明,在酶標儀450 nm處讀取吸光度(A)值。

1.2.3? 免疫組化檢測CHB患者肝組織中Th17和Treg細胞? 采集CHB患者肝穿刺或手術標本,常規10%中性福爾馬林固定,組織脫水透明包埋成組織塊,收集全部標本后,石蠟切片4 μm,用粘附載玻片撈片,60℃烤片2 h后,切片脫蠟至水,蒸餾水水洗2×2 min,PBS 3×2 min,高壓修復2 min,蒸餾水水洗2×2 min,PBS 3×3 min,3%過氧化氫10 min,PBS 3×3 min,加一抗室溫孵育1 h,PBS 4×3 min,加二抗室溫孵育30 min,PBS 4×3 min,加DAB顯色液1~2 min,蘇木素復染,晾干封片。由兩名資深病理診斷醫師對每個切片中6個匯管區的細胞計數總和除以6,得到的平均數作為各個標本中Th17和Treg細胞的數目。

1.3? 統計方法

數據資料經過整理后導入SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示,進行t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 各組被檢測者外周血中Th17細胞和Treg細胞頻率情況

與HC組相比,F3組和F4組患者外周血Th17細胞頻率明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與HC組相比,F2組、F3組和F4組Treg細胞頻率升高差異有統計學意義(P<0.05)。與HC組相比,F2、F4組Th17/Treg值變化差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.2? 各組被檢測者外周血中IL-17和IL-10細胞因子情況

與HC組相比,4組IL-17水平、IL-10水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與HC組相比,F2、F3、F4組IL-17/IL-10值顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

2.3? 各組CHB被檢測者肝組織中Th17及Treg細胞數目檢測結果

與F1組相比,其余3組Th17細胞和Treg細胞數目升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與F1組和F2組相比,F3組和F4組Th17/Treg值降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

HBV感染導致的相關肝病具有發病率高、難治愈等特點,嚴重威脅人類的健康。對于慢性肝病,肝纖維化是其發展過程中的重要階段,也是造成肝臟不可逆性損害的重要因素[1]。目前對于HBV感染導致的肝臟功能紊亂的機制尚不明確,近年來的研究表明,HBV感染引起的相關肝病免疫系統失衡與Th17和Treg細胞有關系,二者失衡可引起免疫系統的功能紊亂[2],主要表現為相關細胞因子和細胞數量的失衡[3]

該實驗顯示,CHB患者外周血中Th17和Treg細胞頻率與HC組相比,均表現為升高的趨勢,但兩者升高的幅度并不相同,說明在HBV患者中存在Th17和Treg細胞的失衡,具體表現為F1、F2反應初期,以Treg細胞升高為主,其與Th17細胞的比值呈現下降趨勢,根據本文數據表明在反應初期階段,HBV刺激機體使Th17細胞大量分化,產生炎性刺激反應后又促使Treg細胞的分化,而Treg細胞具有負向調控功能,會導致機體清除HBV能力下降,使炎癥呈現慢性發展[4],因此在F3、F4期,Th17細胞升高幅度較Treg細胞顯著,表現為對機體產生持續性的炎性刺激,與Treg的比值呈上升趨勢,加重機體纖維化的發展。在CHB患者中,Th17與Treg細胞頻率的比值大致呈升高趨勢,說明在HBV感染過程中,與Treg細胞相比,Th17細胞的分化占據優勢地位,使機體保持炎性刺激,而Treg的活化使反應慢性化,加重纖維化的進程,顧娜等人[5]通過研究,將乙肝纖維化患者分為輕中重度3組并檢測其外周血中Th17/Treg比值,結果顯示隨著乙肝纖維化病情的加重,Th17細胞與Treg細胞的表達率呈上升趨勢,且其比值與輕度組(1.26±0.32)相比,中度組(1.52±0.41)及重度組(1.76±0.49)患者的Th17/Treg比值呈上升趨勢,與該文結果相同。CHB患者外周血中IL-17及IL-10細胞因子與HC組相比,均呈升高趨勢,而兩者的比值與HC組相比呈下降趨勢,但在CHB患者中,其比值呈上升趨勢,說明機體受HBV刺激后產生大量細胞因子來抑制感染,但兩者升高的幅度也存在差異,具體表現為Th17細胞相關因子IL-17的表達水平強于IL-10的表達水平,IL-17的高表達可以通過激活肝星狀細胞加重肝炎的發展,而IL-10的抑制性負反饋調節使HBV清除能力下降,導致病變遷延不愈,進一步肝纖維化的進程[6],徐笛[7]等通過對健康者和HBV患者進行研究發現,IL-17和IL-10的表達隨著纖維化的進展,兩者表達水平均升高,IL-17和IL-10的比值呈現上升趨勢,與該文結果一致。樊海燕等[8]將乙肝患者分為HBV攜帶者、急性乙肝和慢性乙肝進行監測外周血中Th17/Treg比值,結果顯示3組Th17細胞升高幅度較Treg細胞均為明顯,進一步說明,Th17和Treg平衡打破后,機體的炎癥反應呈現慢性化發展,使肝炎癥加重,促進肝纖維化發展。

然而,Th17/Treg平衡的改變不僅體現在CHB患者外周血中,還體現在肝組織中,且與肝臟組織的免疫炎性應答密切相關。該實驗發現,在肝臟組織中,Th17和Treg細胞活化程度與外周血中不相同,肝組織中Th17和Treg細胞均呈升高趨勢,說明肝臟啟動免疫應答來應對HBV的感染,在初期Th17細胞活化并對肝臟進行炎性損傷時,Th17細胞活化分泌IL-17介導炎性反應,引發免疫應答來抑制炎性損傷,繼而刺激肝臟中Treg細胞的活化,其分泌的高水平TGF-β1會抑制Th17細胞分化[9],控制炎癥發展[10]并促進Treg細胞的產生,表現為Treg細胞升高明顯,因此肝臟中Th17細胞活化水平不及Treg細胞,Th17/Treg比值呈下降趨勢,結果是肝臟長期處于慢性免疫炎性應答狀態,加重纖維化的發展[11],而血液中Th17和Treg細胞的監測可能會有一些不確定的因素,導致與肝臟中的比值變化表現不一致。馬海霞[12]通過研究乙肝纖維化患者肝臟組織F1、F2和F3期的Treg/ Th17比值,結果顯示肝組織內Th17和Treg細胞均呈上升趨勢,而Treg/Th17細胞比值呈上升趨勢,F1期為(0.48±0.05),F2期為(0.85±0.15),F3期為(1.09±0.03),差異有統計學意義(均 P<0.001),從其F1、F2、F3期肝臟組織檢測結果看Th17/Treg比值變化與該文趨勢相一致[(2.08±1.06),(1.51±0.77),(1.07±0.86)],呈降低趨勢,然而未檢測相對應的血液中數值變化,但認為HBV是嗜肝細胞性病毒,外周血中Th17和Treg 細胞水平變化與肝臟中相比可能存在差異,而該文結果顯示肝臟和血液中Th17和Treg表達雖然均升高,但Th17/Treg比值與血液中比值變化存在一定的差異,推測肝臟中和血液中的可能存在一些因素影響兩者的比值變化。

綜上所述,從該實驗中可以看出外周血及肝組織中Th17/Treg失衡可以影響HBV感染導致的肝纖維化的進程,而且肝臟中的Th17/Treg比值與血液中比值變化存在一定的差異,但其比率變化在一定程度上可以反映HBV感染肝纖維化的進展程度,對于臨床干預及治療具有重要指導意義。

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(收稿日期:2019-12-13)

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